免疫吸附色谱技术的发展及其在神经科学中的应用
来源：
91360智慧病理网
发布时间：2020-11-13
1、背景
荧光显微光学切片断层成像系统（f-MOST）是一种研究脑神经网络连接的新方法，要对特定的脑组织进行成像，首先要求神经元胞体和纤维被荧光物质标记，如荧光蛋白，为了获得细节更加丰富的神经元连接信息，我们需要对荧光蛋白的荧光信号进行放大，比较常用的信号放大方法是免疫组织化学荧光染色法，其依据的原理是，一个荧光蛋白分子可以和多个带有荧光基团的抗体特异性结合，从而实现荧光蛋白荧光信号的放大，与此同时，对于脑组织内的非荧光内源性物质，要想实现对它们的荧光显微光学成像，也可以通过免疫组织化学的方法进行标记。
对于大体积生物组织，要想实现对于组织中内源性物质的均匀抗体标记，首先需要抗体均匀扩散到生物组织，但由于荧光抗体通常会先和组织外围的抗原结合，并形成一道屏障，阻挡外部的荧光抗体进一步扩散进入生物组织内部。如果能够实现抗原-抗体结合反应的可逆性控制，那么就可以保证抗体在进入组织的时候不发生反应，均匀扩散进入生物组织之后再发生反应，这样一来就实现了抗原的均匀性标记，而免疫吸附色谱法正是研究抗原抗体结合反应可逆性控制的一门科学，研究免疫吸附色谱对于实现大体积生物组织免疫组织化学荧光染色具有重要意义。
免疫亲和色谱法(Immunoaffinity Chromatography，IAC)主要是利用抗原抗体反应有选择性从复杂环境基体中提取待测物，将抗体共价键合到不溶性的固态聚合物上，填充到色谱柱中，由于抗体抗原的可逆性结合，后者被持留，通过改变pH值、离子强度或离液序列高的试剂(Chaotropic agents)及有机溶剂释放出抗原。
通常情况下，抗原-抗体的结合发生在中性或者略高于中性的磷酸盐缓冲液或含有氯化钠的硼酸盐缓冲液中，也可能是在非离子型表面活性剂中。固定化的单克隆抗体，就像任何蛋白质一样，在其表面上具有带电基团，并倾向于作为混合离子交换剂，以便在缓冲液中的盐的存在下，将减少离子相互作用。使用洗涤剂并不总是合适的，特别是对潜在的治疗产品，由于从蛋白质中清除洗涤剂很困难。
2、技术简介
从吸附剂洗脱抗原被称为IAC的“黑色艺术”。洗脱策略一般可分为：
（1）改变体系pH
（2）使用离液序列高的盐
（3）改变离子强度
（4）使用变性试剂
（5）使用有机试剂
（6）改变物理条件，如温度、压力、电场强度
洗脱剂的目的是建立导致其抗原的抗体的亲和力降低的条件，使抗原返回到溶液中，并可以在洗脱液中被收集。关键在于在实现上述功能的同时保留抗原和抗体的活性。
改变pH是洗脱抗原最常见的方法，更加常见的是用甘氨酸缓冲液、乙酸或丙酸将pH调至酸性范围，因为鼠源的单克隆抗体即便是被固定之后在碱性pH条件下也是不稳定的。丙酸对于增加洗脱液极性来讲具有显著效果，这可能有助于分解疏水力发挥的一部分而稳定的抗原抗体复合物。高pH也有使用，一般通过氨水、碳酸盐或胺类如乙醇胺来实现。
离液离子通过影响水的结构和减少疏水相互作用来施加影响，这些用于IAC洗脱的离子按照离液序列增加的顺序排列如下：
Cl-< I- < ClO4- < CF3COO- < SCN- < CCl3COO-
在中性缓冲液这浓度达到3M的硫氰酸盐和碘化物是最常用的离液离子。
增加溶剂的离子强度是一个温和的洗脱条件，但使用氯化钠的时候它很难有效。常用的二价离子盐阳离子有镁离子和钙离子。4.5M的MgCl2的离子强度是13.5M，并且氯离子浓度是9M。这可能在一定程度上解释这种同时具有高浓度和低离液序列的溶液可以破坏离子相互作用，另外钙离子和镁离子的离液序列比钠离子和钾离子要高。
在IAC中最常见的变性试剂是6-8M的尿素和3-4M的盐酸胍，这种变性试剂最好不要用，除非它可以协助吸附剂的清洗。
有机溶剂在某些情况下备受青睐，乙二醇除外，因为它很少用于IAC，在可用于抗原洗脱的其他技术的范围内，也许最优雅的是在辅因子的存在下使用单克隆抗体识别只存在于蛋白质的表面上抗原表位。因素IX和凝血酶原通过单克隆抗体仅与钙含载脂蛋白的相互作用被分离（61）。洗脱引起EDTA中的存在的Ca2 +结合后又是一个只适用于辅助因子的蛋白质，在其载脂蛋白和全息形式稳定技术。采用温度或压力的变化，以及电泳洗脱技术进行了研究（55），但没有发现广泛接受。
3、技术应用
免疫吸附色谱（Immunoaffinity Chromatography, IAC）是一种常见的蛋白质分离纯化手段，它所依据的原理是抗原和抗体的特异性结合，尤其是单克隆抗体（Monoclonal Antibodies, mAbs），它常用于IAC，具体的做法是，首先，将单克隆抗体通过共价键偶联在亲水性多孔凝胶介质上，并将偶联了抗体的凝胶装填在色谱柱中，然后通过加压迫使待分离的蛋白质溶液缓慢流过色谱柱，此处的蛋白质溶液体系是有利于抗原抗体结合反应发生的体系，等到待分离的蛋白质溶液完全从色谱柱流出，开始用淋洗液淋洗，洗去非特异性结合的蛋白质成分，最后用洗脱液将被抗体固定下来的特定蛋白质洗脱下来，即可实现该种蛋白质的纯化与富集。
一种蛋白质作为一种特定的抗原，它往往对应着多种抗体，不同抗体识别该抗原的不同表位，并且和该抗原的结合反应对于pH和离子强度的敏感性不一样，如果要用IAC的方法纯化该蛋白质，则需要用抗原抗体反应对pH和离子强度的敏感性高的抗体，为了找出适合用IAC方法纯化牛科β- 乳球蛋白的抗体，本文对多种单克隆抗体和牛科β- 乳球蛋白之间相互作用与pH和离子强度的依赖性进行研究对比。
上图展示的是10种抗体和pH=7时相比在pH=3~11的条件下与抗原结合的相对结合活性变化图。
看得出来，整体上来看，过高或过低的pH条件都不利于抗原和抗体的结合，但不同抗体对于pH的敏感性和响应特性显然不一样。
上图展示的是10种抗体和离子强度=0.02mol/kg时相比在离子强度=0~0.6的条件下与抗原结合的相对结合活性变化图。
看得出来，整体上来看，过高的离子强度不利于抗原和抗体的结合，但不同抗体对于离子强度的敏感性和响应特性显然不一样。
上图展示的是3种典型的抗体在和抗原结合之后被不同化学条件的洗脱液洗脱之后抗体残留率的变化图。
看得出来，pH降低对抗体残留率的影响更大，而离子强度增大对于LG5.2抗体的残留率的影响较大。
61C1抗体对于pH的敏感性最大，LG5.2抗体同时对pH和离子强度都很敏感。
一个抗原-抗体结合的反应包含多种非共价键的形成，比如氢键、静电力、范德华力和疏水相互作用，这一结合通过表面形貌互补来实现，并且单个吸引力的多样性促成了很高的结合能。尽管键合作用表明了抗体和抗原形成稳定复合物的趋势，缔合常数较低的抗体对于pH和离子强度的改变不敏感。
尤为重要的是，静电力和疏水相互作用可能会成为一个主要因素，因为这两种作用力对于抗原抗体结合的贡献最大。通常情况下，随着离子强度的增大，静电力倾向于减小，但是疏水相互作用增加。与抗原结合的作用受离子强度影响最大的3种抗体，它们都包含6个带电的氨基酸残基。在这些抗原抗体结合的反应中，静电力的作用比疏水相互作用显著，这导致了它们对于离子强度的高度敏感。从另一方面来讲，21B3抗体和抗原的结合部位有一个带电基团和很多疏水残基，这导致它对离子强度很不敏感。
尽管很多带电残基参与LG4.1、LG8.2和LG13.1抗体的抗原识别过程，但最近的研究却证实这3种抗体可能识别的是疏水残基，对于61B4抗体，虽然它的抗原决定簇中带电残基所占的比重很高，但它和抗原的结合过程为什么会对离子强度和pH不敏感，现在仍不清楚。
我们的结果也证实了高敏感性的抗体可能分子量很小，在我们研究的10种抗体里面，只有2种对于离子强度和pH是敏感的。
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